Створюються градієнти щільності середовищ, що затримують саме ці клітини за рахунок їх щільності: фіколл-верографін, фіколл-гіпак, плазма-Перколла та ін. У ряді випадків від еритроцитів звільняються за допомогою різних лізуючого розчинів і т.д. Оцінка стану трьох основних ланок імунітету - Т-, В- і фагоцитарного, поділяється на кількісну і функціональну. Кількісне тестування популяцій і субпопуляцій лімфоцитів засноване на характеристиці специфічних для кожного виду клітин рецепторів, по їх здатності зв'язуватися з Аг або з клітинами. Так, Т-лімфоцити, наприклад, несуть рецептори до еритроцитів барана і утворюють з ними так звані Е-РОК. Підрахувавши відсоток таких клітин і перевівши його в абсолютні значення, можна визначити вміст Т-лімфоцитів. В-клітини утворюють розетки або з еритроцитами мишей, або з еритроцитами бика, навантаженими AT проти них і комплементом - ЕАС-РОК.
Більш чутливою є ідентифікація клітин за допомогою моноклональних AT проти маркерних Аг популяцій і субпопуляцій лімфоцитів. Досліджувані лімфоцити обробляють монокль-нальними AT (анти-CD), далі або діагностикумами, навантаженими AT проти «перших» AT, або AT і їх Fab-фрагментами (проти «перших» AT), міченими флуорохромами, що дають специфічне світіння в люмінесцентному мікроскопі. Створені лазерні сортери (проточні цитофлуориметрії) для виявлення субпопуляцій лімфоцитів, мічених таким чином моноклональними AT.
Для оцінки функціональної активності клітинної ланки імунітету використовують 4 групи методів.
1. Постановка шкірних проб ГЗТ.
2. Стимуляція лімфоцитів in vitro в РБТЛ
3. Функціональна оцінка Т-хелперів.
4. Функціональна оцінка Т-супресорів (кілерних клітин і т. Д.). Для постановки шкірних проб використовується: очищений туберкулін (реакція Пірке), паротитної, стрептококовий, правцевий, дифтерійний Аг, трихофітії, кандідін, стрептокіназа, дінітрох-лорбензол та ін .
Стимуляція лімфоцитів в РБТЛ заснована на здатності лімфоцитів при певних умовах перетворюватися на збільшені бластоподобние клітини, що активно синтезують ДНК. Для характеристики функції Т-хелперів мононуклеарние клітини крові инкубируются з поліклональним активатором лімфоцитів мітогеном лаконоса і кількісно вимірюють индуцированную їм продукцію імуноглобулінів. Далі в систему додають клітини з передбачуваною хелперной здатністю і визначають приріст освіти імуноглобулінів. Для оцінки функції Т-супресорів відтворюється описана вище методика, але в культуру додають клітини з супрессорной активністю, реєструючи зниження сумарних імуноглобулінів.
Одним з методів оцінки функціональної активності В-лімфо- цитов є оцінка синтезу імуноглобулінів в культурі цих клітин, а також визначення в сироватці крові, слині, кишковому вмісті кількості імунних глобулінів основних класів. Для цього використовується метод двовимірної дифузії в агарових гелі, розроблений Манчіні (в лунки агарового гелю, що містить AT до різних класів імуноглобулінів, додають шукані сироватки, що містять Ig, утворюються кільця преципітації, розмір яких по номограммам дозволяє визначити концентрацію Ig різних класів). Додатковим показником в оцінці гуморального імунітету є визначення концентрації природних AT, наприклад, ізогемагглютінінов (титр в нормі 1: 16-1: 64), рівень AT до кишкової палички, Аг коклюшного збудника, дифтерії, правця, оскільки переважна більшість людей імунізовані даними Аг в плановому порядку, тобто AT проти зазначених Аг повинні бути у всіх.
Для вимірювання функції системи фагоцитозу вивчається мікробоцідная здатність, фагоцитарна активність, рухливість моноцитів і гранулярних лейкоцитів (гранулоцитів). Метаболічна здатність визначається непрямим шляхом в тесті відновлення нітросинім тетразолия, використовуючи спонтанну та індуковану реакції. Кисневий метаболізм фагоцитів також вивчають методом хе-мілюмінесценціі, який обумовлений генерацією Н202 і супероксидного радикала і прямо корелює з киллерной здатністю клітини. Застосовуються методи дозволяють визначити безпосередньо кисневий метаболізм, утворення різних активних кисневих радикалів індивідуальними клітинами. Останній аналіз може виконуватися на проточному цитофлуориметрії.
Поглинювальні можливості визначають у реакції фагоцитозу зазначених клітин будь-яких об'єктів: бактерій, дріжджових клітин, часток латексу, зімозана і т.д. Підраховується відсоток фагоцитуючих лейкоцитів і фагоцитарний індекс, що відображає середнє число поглинених одним фагоцитом частинок при підрахунку 100 клітин. Для оцінки функціональних резервів фагоцитуючих клітин використовували фагоцитарную реакцію з визначенням фагоцитарного показника і фагоцитарного числа. Для визначення перетравлює здібності клітин реакцію враховували через 30 хв і через 2 ч. В якості стимулятора in vitro використовували продигиозан. Кілерні здатність фагоцитів може бути визначена безпосередньо по киллинга живих дріжджів, який оцінюється за допомогою барвника акридинового оранжевого, застосовуються і спеціальні барвники, що дозволяють визначити киллинг бактерій окремими фагоцитами на проточному цитофлуориметрії.
Рухливість фагоцитів, зокрема нейтрофілів або моноцитів периферичної крові, вимірюється або за величиною спонтанної міграції з капілярів за певний проміжок часу, або з вимірювання цієї реакції в присутності речовин, що володіють хемотаксичною дією. Аналізується також адгезія на поверхню або їх агрегація, чітко відображають функціональну активність клітин, в тому числі обумовлюється молекулами адгезії. Визначення рецепторів на нейтрофілах або моноцитах також проводиться для оцінки функціональної активності фагоцитарної системи. Оцінка системи комплементу проводиться в гемолітичної системі, що складається з еритроцитів барана зі специфічною антисироваткою до них. Сироватку попередньо прогрівають при 56 ° С протягом 30 хв для руйнування власного комплементу, а потім додають її в досліджувану сироватку як джерело AT. Розраховується 50% гемоліз, зміст комплементу виражають в одиницях С'Н50 (одиниця активності комплементу, за яку приймають кількість комплементу, що викликає 50% лізис певної кількості сенсибілізованих специфічними AT еритроцитів).
Кількісне визначення компонентів комплементу та інгібіторів проводиться імунохімічний методом з використанням моноспецифічних анти-сироваток за методом Манчіні або в системі, де відсутній будь-який певний компонент системи комплементу, а інші її компоненти присутні в надлишку. Активність кілерних клітин вимірюється в пробах з мішенями, міченими радіоактивними ізотопами, які виділяються в культурне середовище після руйнування клітин кілером.
До специфічних методів оцінки імунного статусу відносять імунофлуоресценція - використання AT, мічених іммунофлуоресцірующім барвником, наприклад флуоресцен-ном ізотіоцианатом, родаміном та ін. З їх допомогою виявляють місця локалізації Аг. В ультрафіолетовому світлі вони добре видно. При радіоімунному методі використовують мічені радіонуклідами I131 або I125 (радіоізотопи йоду) AT або Аг. Застосовують стандартна кількість антисироватки, що зв'язує 70-80% міченого Аг. Потім в реагуючу систему вносять шуканий немічених Аг. Він конкурує з міченим за AT. Сумарна радіоактивність реагує системи падає. Чим більше немічених Аг в системі, тим більшою мірою знижується її радіоактивність, яку можна виміряти, і за отриманими даними визначити зміст шуканого (немічених) Аг в досліджуваній смесі.Метод імуноферментного аналізу (ІФА) чутливий і досить простий. Реакцію зазвичай ставлять в пластикових планшетах, до полістиролу лунок фіксують AT до Аг, який слід виявити в матеріалі-в іншій модифікації можна використовувати маркерний Аг. Далі вноситься досліджуваний субстрат, що містить шуканий Аг. Він з'єднується з AT, утворюючи комплекс Аг-АТ. Чи не прореагував досліджуваний субстрат видаляють і замість нього вносять AT, мічені яким-небудь ферментом, наприклад, пероксидазою хрону. Вони приєднуються до комплексу Аг-АТ, адсорбована на полістиролі лунки. Далі в систему вносять речовина, що дає кольорову реакцію у присутності пероксидази хрону. За інтенсивністю фарбування кількісно оцінюється реакція.
Найцікавіші новини