У 1977 р австрійський онколог V. Lapin організувала і провела у Відні перший міжнародний симпозіум, присвячений впливу пінеальною залози на процес злоякісного росту. Назва симпозіуму звучало багатообіцяюче: «Пинеальная заліза: новий підхід до механізму нейроендокрінного впливу при раку». Цей симпозіум, систематизуються дані, отримані до кінця 70-х рр. XX ст., Може розглядатися як відправна точка в сучасних дослідженнях ролі пінеальною залози і МТ у патогенезі неопластического зростання. Основною метою цих досліджень є розробка нових діагностичних і терапевтичних підходів для оптимізації лікування пухлин у людини.
Онкостатичну роль пінеальною залози була вивчена в різних моделях канцерогенезу з використанням таких класичних експериментальних методів, як зміна фотоперіоду, пінеалектомія або вплив МТ. Всупереч спочатку висловлену думку Georgiou про те, що пинеальная заліза стимулює ріст пухлини, в даний час загальновизнано, що експериментальні впливу, які активізують функцію пінеальною залози або введення МТ, скорочують кількість випадків виникнення і розвитку пухлин, у той час як пінеалектомія стимулює ріст пухлин. Антипухлинні ефекти МТ, на думку дослідників, можуть включати його вплив на синтез і секрецію гіпофізарних і статевих гормонів, залучених в ріст пухлин, модуляцію їм імунної відповіді на наявність пухлинних клітин, дію як ендогенного антиоксиданту і його прямі цитостатические ефекти на пухлинні клітини.
Через складної взаємодії гормонів і факторів росту, залучених в регуляцію росту пухлин, а також через різноманіття фізіологічних ефектів МТ важко зробити висновок про унітарну механізмі антипухлинним дії МТ в експериментах in vivo. Ці обставини зумовили вивчення антипухлинним ефекту МТ в основному in vitro, з використанням різних культур пухлинних клітин.
Ефекти мелатоніну в культурі пухлин молочної залози
Прямі ефекти МТ на ріст злоякісних пухлин молочної залози були вивчені in vitro, в основному на культурі пухлинних клітин людини MCF-7. Ця культура пасерують з пухлинних клітин, метастазуючих в плевру, в яких присутні рецептори до естрогену і прогестерону. Зростання MCF-7 клітин залежимо від естрогенів. Таким чином, ці клітини є зручну модель для вивчення молекулярних механізмів участі естрогенів у патогенезі раку молочної залози.
Вперше ефекти МТ на зростання MCF-7 клітин були описані Blask, при цьому виявилося, що МТ перешкоджає проліферації MCF-7 клітин in vitro. Інгібуючий ефект МТ є оборотним - логарифмічний зростання MCF-7 клітин відновлюється після заміни живильного середовища, що містить МТ, на нове середовище, зазнає його недолік. Цікавим виявився зареєстрований факт, що попередники МТ, його метаболіти та інші пинеальная метоксііндоли володіють більшою цитотоксичність, ніж сам МТ по відношенню до MCF-7 клітинам. На думку багатьох авторів, сприйнятливість MCF-7 клітин до ростзапрещающему ефекту МТ може залежати від концентрації МТ в середовищі. Було показано, що тільки концентрації МТ в межах фізіологічного діапазону, особливо доза 1 пМ, рівна нічному пікового рівня, перешкоджають зростанню MCF-7 клітин, в той час як більш високі (0,1 рМ, 10 рМ) або, навпаки, більш низькі (10 рМ, 0,1 рМ) концентрації є неефективними. Крива дозозависимого антипролиферативного дії МТ на MCF-7 клітини має колоколообразную форму з максимальним ефектом, що збігається з 1ПМ концентрацією.
У спеціальних експериментах було показано, що проліферація пухлинних клітин залежить від ритму дії МТ. Для MCF-7 клітин найвищий антіпроліфератівний ефект МТ був досягнутий в тому випадку, коли його концентрації змінювалися кожні 12 годин від 1ПМ до ЮПМ, відтворюючи, таким чином, добові ритми коливань вмісту МТ у ссавців і людини. Відзначено, що ефективність дії МТ залежить і від естроген-рецетггорного статусу пухлинних клітин. Було показано, що, так само як у MCF-7 клітинах, МТ перешкоджає проліферації і в інших естроген-залежних пухлинних культурах (T47D, ZR-75-1), але не проявляє свого антипухлинним дії в естроген-нечутливих лініях пухлинних клітин молочної залози (BD-20, MDA-МВ-231, MDA-MB-364, Hs587t, T47Dco).
Крім того, прояв антііроліфератівних властивостей МТ вимагає присутності певних поживних факторів в середовищі, в якому ростуть пухлинні клітини. МТ втрачає свої антипухлинні властивості, якщо MCF-7 клітини водночас не піддані дії таких митогенов, як естрадіол, пролактин або епідермальний фактор росту, при цьому МТ блокує мітогенний ефект естрадіолу, пролактину і епідермального фактора росту на MCF-7 проліферуючі клітини. У ряді експериментів виявлено антиметастатичну дію МТ. Попередня обробка MCF-7 клітин МТ в дозі 1ПМ зменшує вростання MCF-7 клітин в ламініновую мембрану, яка у ролі артіфіціальной серози, на 74%. Вплив МТ (1 пМ) на культуру MCF-7 клітин протягом 5 днів чинило виражений хемостатіческій ефект, який був відсутній у культурі клітин, що не підданої дії МТ.
Інвазивний ріст пухлини залежить від рухливості пухлинних клітин. Інвазія і рухливість - два взаємозалежних процесу, можливі тільки при експресії особливих молекул - интегринов. Інтегрііи являють собою мембранні пептиди, які здійснюють взаємодії клітин між собою та прилеглої тканиною. Зниження або повна відсутність експресії цих молекул на мембрані клітин корелює зі збільшенням агресивності клітин пухлини і їх слабкої дифференцировкой, а звідси і з несприятливим прогнозом розвитку пухлини. У MCF-7 пухлинних клітинах МТ підсилює експресію кадеріна Е - кальцій-залежного мембранного білка, відповідального за адгезивні міжклітинні контакти. Експресія кадеріна Е проявляє достовірну негативну кореляцію з інвазією пухлинних клітин in vitro і ступенем диференціювання пухлинних клітин. Крім того, виявлено, що МТ також здатний підсилювати експресію интегринов (31 - рецепторних білків, які регулюють взаємодію між клітинами і екстраклеточной матрицею.
МТ знижує життєздатність MCF-7 пухлинних клітин і збільшує відсоток їх загибелі у формі апоптозу. Відомо, що в процес регуляції апоптозу залучено велику кількість генів, які класифікуються за трьома категоріями: гени - супресори апоптозу (типу bcl-2 і bcl-x) - гени, які діють як виконавчі елементи апоптозу (типу Ьах) - проміжні гени (типу Fas Fas ліганд, р53, туї та WAF1). Відомо, що р53-онкосупрессорний ген затримує прогресію пухлинних клітин на стадії G1 і тим самим ініціює пошкодження ДНК, що приводить до апоптозу клітин. Таке функціонування р53 можливо тільки при індукції WAF1 гена. Виявлено, що експресія р53 і WAF1 генів у MCF-7 пухлинних клітинах збільшується при дії МТ. Незважаючи на проведені експерименти, достовірні дані про вплив МТ на експресію генів bcl-2, bcl-x і Ьах поки не отримані.
Ефекти мелатоніну на клітини меланоми
Меланоцити - клітини нейроектодермального походження, здатні синтезувати меланін з амінокислоти L-тирозину. Порушення проліферації меланоцитів в шкірі може призвести до розвитку злоякісних пухлин - меланом, що характеризуються високим ступенем прогресії і метастазування. Встановлено, що пінеалектомія сприяє розвитку первинних меланом, трансплантуються сирійським хом'якам, однак при введенні МТ подібний ефект у пінеалектомірованних хом'яків зникає.
При дослідженні клоногенних клітинних ліній меланоми у тварин і людини було виявлено, що міллімолярной концентрації МТ приводили до 25% -го зниження темпів зростання клонованої лінії клітин меланоми В7, отриманої від спонтанно виниклої пухлини у самця золотистого хом'яка, в той час як мікромолярних концентрації МТ, навпаки, викликали 37% -ве прискорення зростання пухлинних клітин. Bartsch et al., Вивчаючи культивовані клітини меланоми людини, встановили, що мікромолярних концентрації МТ призводять до 60% -го зниження темпів проліферації клітин, тоді як підвищення дози МТ в 10 разів стимулює ріст пухлинних клітин. Ці дані свідчать про те, що МТ по відношенню до клітин меланоми має дозозалежний біфазної ефект. Цікавий той факт, що в цьому ж експерименті фізіологічні дози МТ не чинили ніяких ефектів.
Bartsch et al. також виявили, що різна чутливість клітин меланоми людини до МТ залежить від темпів клітинного росту. МТ здійснює інгібуючу дію на клітини меланоми при їх помірному зростанні, але неефективний в культурах пухлинних клітин з високим рівнем проліферації. Поведінка клітин меланоми залежить від наявності або відсутності стероїдних рецепторів в пухлинних клітинах. Втрата чутливості клітин меланоми до МТ може бути пов'язана або з відсутністю стероїдних рецепторів на поверхні пухлинних клітин, або з селекцією клітинних клонів. Також було продемонстровано, що МТ значно перешкоджає росту клітин увеальной меланоми людини in vitro при використанні його в концентраціях 0,1-100 пМ. Ці дані дозволяють вважати перспективним використання МТ для лікування увеальна меланом, що характеризуються високим ступенем метастазування.
Різні ефекти МТ на проліферацію клітин і меланогенез були описані і для S91 клітинної лінії меланоми у мишей і для AbCl клітинної лінії меланоми у хом'яків. У низьких концентраціях (0,1-10 пМ) МТ перешкоджав проліферації клітин, але не впливав на меланогенез, однак при підвищенні концентрації в 10 разів МТ гальмував індукцію меланогенеза і стимулював проліферацію клітин, що свідчить про здатність МТ впливати на ріст клітин меланоми через різні механізми. Цікавий той факт, що МТ у фармакологічних дозах скорочує число a-MSH рецепторів, а при фізіологічних дозах зупиняє індукцію синтезу тирозинази в клітинах меланоми. Механізм інгібуючого ефекту МТ на клітини меланоми до кінця не ясний. Можливо, він реалізується через рецептори до МТ на клітинах меланом різних типів, оскільки присутність рецепторів до МТ показано на RPMI1846 меланомних клітинах, В16 клітинах і S91 клітинах меланоми мишей, SK Ме128 і SK Ме130 клітинах меланоми. Іншим імовірним механізмом антипухлинним дії МТ є його взаємодія з естроген-рецепторами, також виявленими в клітинах деяких типів меланом людини і гризунів.
Ефекти мелатоніну на клітини пухлин жіночих репродуктивних органів
Є дані про те, що МТ і N-ацетілсеротонін перешкоджали зростанню SK-OV-3 і JA-1 карцином яєчників тільки в пМ концентраціях, при цьому інші попередники і метаболіти МТ - 5-метоксітріптамін і 6-гідроксімелатонін - були в 5 разів більше ефективні. У той же час не виявлено придушення проліферації KF-клітин, отриманих з цістаденокарціноми яєчників людини навіть при використанні такої високої дози МТ, як 200 рМ. Мікромолярних концентрації МТ перешкоджають проліферації естроген-чутливої внутрішньоматкової аденокарциноми людини типу RL95-2, тоді як фізіологічні рівні МТ (1ПМ) не роблять ефекту на ріст клітин.
Незважаючи на те що МТ в концентраціях нижче 1 рМ не діє на мітоз клітин пухлин яєчника, при дії 0,1 рМ колхіцину на клітини, які були преінкубіровалі до цього з МТ в дозі 100 рМ, спостерігалося зниження митотических показників у порівнянні з дією одного колхіцину. При дослідженні ракових пухлин яєчників було встановлено, що МТ в концентрації 2 рМ перешкоджає росту клітин після 48 годин інкубації, однак в концентрації 0,1 рМ МТ НЕ оказивет ефекту на проліферацію пухлинних клітин. При вивченні JAR-клітинної лінії трофобластической пухлини плаценти було показано, що МТ та інші пинеальная індоли перешкоджають включенню iH-тимідину в JAR-клітини при використанні їх у концентраціях від 4 рМ до 500 рМ.
Ефекти мелатоніну на клітини інших пухлин. Виявлено, що МТ в концентраціях ЮрМ і 1ПМ значно перешкоджає проліферації клітин нейробластоми людини лінії SK-N-SH in vitro, в той час як супрафізіологіческіх концентрації МТ неефективні щодо клітин цієї лінії пухлини. Через 8 днів після впливу МТ пухлинні клітини виявляли більш високу диффе-ренціровку, відображенням чого стало посилення росту нервових відростків в порівнянні з відсутністю цього в контрольних лініях. Клітини нейробластоми часто використовуються як модель вивчення можливого використання МТ у лікуванні хвороби Альцгеймера. Було показано, що МТ у фармакологічних дозах перешкоджає секреції білка-попередника бета-амілоїду (B-АРР) в нейробластомних клітинах. МТ ефективний у запобіганні загибелі ній-робластомних клітин в умовах дії вільних радикалів і внутрішньоклітинного збільшення СА1 +, викликаного впливом цитотоксического фрагмента B-АРР.
Антиоксидантні ефекти МТ і N-ацетілсеротоніна були продемонстровані в SK-N-MC культурі нейробластомних клітин. Виявлено, що фізіологічні концентрації МТ стимулюють збільшення мікротрубочок в нейробластомних N1E-115 клітинах. Ефекти різних концентрацій МТ на проліферацію гіпофізарних пролактин-секретирующих пухлинних клітин щурів були досліджені in vitro, з використанням вимірювання інкорпорації iH-тимідину клітинами пухлини. МТ виявився ефективний тільки в дозі 0,1 рМ, перешкоджаючи інкорпорації iH-тимідину. Є відомості про те, що МТ перешкоджає проліферації Нер-2 ракових клітин гортані тільки в концентраціях вище, ніж 0,5 рМ.
МТ в концентраціях до 1 рМ не діє на мітоз в клітках, що культивуються з епідермоїдний карцином порожнини рота. Однак коли ці клітини були преінкубіровалі з МТ в дозі 100 рМ, антимітотичну дію 0,1 рМ колхіцину на них було значно більш виражено, ніж на клітини, попередньо не оброблені МТ. МТ проявляє виражену інгібуючу дію на ріст RT112-клітин, отриманих з перехідного раку сечового міхура людини, але тільки у відносно високих концентраціях, рівних і перевищують 0,5 рМ. МТ викликає біфазної відповідь в клітинах феохромоцитоми щура лінії РС12: в низьких концентраціях (1-10 пМ) він пригнічує ріст РС12-клітин, а при більш високих концентраціях (10 рМ), навпаки, віддаляє наступ апоптозу пухлинних клітин. Було виявлено, що МТ в мікромолярних концентраціях знижує експресію B-АРР, B-актину і гліцералдегід-3-фосфатдегідрогенази в пухлинних РС12-клітинах.
Описано порівняльні ефекти мікромолярних концентрацій МТ та інших пинеальная індолів на проліферацію клітин лімфосаркоми S180. У той час як метоксітріптамін надав виражений антіпроліфератівний ефект, дія МТ було найбільш слабким. Показано, що МТ значно перешкоджає інкорпорації iH-тимідину в Т-лімфоцитах і в Т-лімфобластів здорової миші і людини, тоді як по відношенню до мієломні клітинам він проявляє властивості, що стимулюють проліферацію. Механізми онкостатичну дії мелатоніну. Аналіз викладеного матеріалу дозволяє вважати, що Онкостатіческое дію МТ in vitro найбільш чітко проявляється по відношенню до деяких MCF-7 клітинним пухлинним лініях раку молочної залози. Таке антипухлинним дія виражається в зниженні проліферативної здатності клітин, збільшенні числа клітин, що гинуть у формі апоптозу, і зниженні метастазування.
При цьому важливо з'ясувати, як онкостатичну ефекти МТ реалізуються в пухлинних клітинах і які внутрішньоклітинні механізми залучені в антипухлинні ефекти МТ? Незважаючи на те що експресія мембранних рецепторів МТ була описана в різних клітинах, всі спроби верифікації рецепторів МТ на мембрані MCF-7 пухлинних клітин молочної залози виявилися безуспішними. Вивчалася можливість безпосереднього проникнення МТ в цитоплазму клітин і взаємодію його з клітинним ядром, так як МТ є ліпофільній молекулою і може контактувати не тільки з цитоплазматичної, але й з ядерною мембраною клітин. Виявлено, що MCF-7 клітини експресують різні ядерні рецептори, включаючи деякі члени RZR ROR- сімейства, які є ядерними рецепторами МТ. Дані про регулюючому ефекті МТ в циклічній клітинної кінетики підтверджують, що саме ядерні рецептори MCF-7 клітин можуть служити мішенню для реалізації МТ його антипухлинних ефектів.
При виявленні рецепторів естрогену в пухлинних клітинах молочної залози людини, які проявляли чутливість до антімітогенним ефектам МТ, з'явилася гіпотеза про те, що онкостатичну ефекти МТ реалізуються через них і що МТ поводиться як природний антиестроген. Дійсно, існування зв'язків між антипухлинним ефектом МТ на зростання MCF-7 пухлинних клітин і естрогенавісімимі шляхами підтверджується здатністю МТ до блокади мітогенного дії естрадіолу, що тим самим перешкоджає виживанню клітин, стійких до дії антипухлинним препарату, - тамоксифена в клітинному монослое, культивованому в клоногенних м'якому агарі. Детальні характеристики ефектів МТ на рецептори естрогену неоднозначні. Було встановлено, що при інкубації in vitro MCF-7 клітин з МТ в дозі 1 пМ збільшувалося число цитозольних і ядерних естроген-рецепторів.
У той же час виявлено, що МТ має біфазної ефект: суп-рафізіологіческіе його концентрації (0,1-10 рМ) посилюють експресію рецепторів естрогену, в той час як фізіологічні концентрації МТ (10 пМ - 10 рМ) знижують експресію естроген-рецепторів. Останнє призводить до ослаблення ефектів естрогену і перешкоджає росту MCF-7 клітин. У демонстрації описаних ефектів не встановлено прямої дії МТ на естроген-рецептори. Мабуть, МТ може модулювати експресію естроген-рецепторів через який-небудь фактор-посередник або, взаємодіючи зі своїми власними рецепторами, приводити до каскаду реакцій, здатних регулювати експресію естроген-рецепторів. При цьому ефекти МТ в супрафізіологіческіх концентраціях можна пояснити тим, що посилення експресії ядерних рецепторів МТ може пригнічувати сигнальні грансдукціонние події в ланцюзі регуляції експресії рецепторів естрогену.
Аналізуючи численні дані про антипухлинних ефектах МТ, можна припустити, що механізм дії МТ більш складний, ніж просте «заборона» ім транскрипционной функції естроген-рецепторів. Встановлено, що дія МТ складається з комбінації послідовно розвиваються «ранніх і пізніх подій». Ранні події включають трансдукцію регуляторного сигналу і реалізуються через посилення експресії TGF-a, TGF-p, білків pS2, з-шус і c-fos. До пізніх подій відноситься включення регуляції естроген-рецепторів з наступною модуляцією дії естрогену, пов'язаного з факторами росту. МТ стимулює експресію ріст-заборонного фактора TGF-p, який зазвичай регулюється естрогенами і знижується при дії c-fos та інших протоонкогенов, пов'язаних з клітинної проліферацією, в свою чергу знаходиться під регуляторним впливом стероїдів.
Ці дані підтримують гіпотезу про те, що МТ перешкоджає росту MCF-7 клітин, взаємодіючи з естроген-залежними сигналами. Однак при цьому слід враховувати здатність МТ посилювати експресію таких факторів росту, як TGF-a, з-шус і pS2, які зазвичай регулюються естрадіолом та мають пряме мітогенний дію на MCF-7 клітини. Одним з найбільш цікавих проявів антипухлинним активності МТ є його здатність перешкоджати зростанню пухлин, блокуючи стимулюючі ефекти інших гормонів і факторів росту. На ріст пухлинних клітин карцином молочної залози впливає не тільки естроген, але і пролактин та інші пептидні ростові фактори.
Продемонстровано, що МТ може блокувати мітогеном ефекти пролактину, що підсилює ріст пухлини. Можливо, при цьому Онкостатіческое вплив МТ може бути також пов'язане з його антагонізмом по відношенню до пролактину. Також було показано, що МТ знижує експресію епідермального фактора росту, що стимулює зростання MCF-7 клітин в агаровой середовищі. Крім того, МТ не тільки блокував естрадіол-обумовлену стимуляцію факторів росту і тим самим проліферацію клітин, але також посилював і експресію «заборонних» факторів росту (а саме TGF-p) в середовищі, де культивувалися MCF-7 клітини. У ланцюг подій, залучених до інгібуючу дію МТ на проліферацію клітин, може бути включений і прямий ефект дії МТ на пухлинні клітини. Виявлено, що МТ, з одного боку, збільшує тривалість клітинного циклу клітини, подовжуючи стадії G1 і G2, збільшуючи, таким чином, частку клітин на цій стадії і затримуючи початок S-стадії, що дозволяє пухлинних клітин досягти більшою мірою діфференціровкі- з іншого боку , МТ може послаблювати синтез ДНК в клітинах, що знаходяться на S-стадії клітинного циклу.
Побічно онкостатичну ефекти МТ можуть бути обумовлені його антиоксидантними властивостями. Встановлено, що інгібуючий ефект фізіологічних концентрацій МТ на проліферацію MCF-7 клітин реалізується в присутності низьких концентрацій глютатиона. Можлива роль МТ як інгібітора клітинної проліферації в умовах експериментального канцерогенезу була запропонована Blask et al. Їх погляд грунтується на аналізі експериментів, в яких було продемонстровано антипроліферативну дію окису азоту на клітини меланоми лінії А375. Blask et al. інкубували MCF-7 клітини карциноми молочної залози протягом 5 днів з МТ в дозі 1ПМ у присутності або за відсутності NMMA - інгібітора ферменту синтезу N0. У присутності NM М А антіпрол іфератівн ий ефект МТ знижувався. Автори вважають, що критичний пороговий рівень NO необхідний для МТ, щоб він зміг проявити свій онкостатичну ефект.
Цілком імовірні й інші можливі механізми, які можуть бути залучені в Онкостатіческое дію МТ на пухлинні клітини. Один з них може бути пов'язаний з ефектами МТ на організацію цитоскелету в якості саг - кальмодулінового антагоніста. Ще один цікавий механізм, що вимагає детального вивчення, - це можливі ефекти МТ на формування адгезійних міжклітинних зв'язків. Більшість злоякісних пухлин мають порушення в адгезії клітин, пов'язані з дефектами в об'єднанні клітин або з відсутністю функціональних міжклітинних зв'язків. Є припущення про те, що МТ може посилювати експресію молекул адгезії і тим самим пригнічувати ріст пухлини.
Найцікавіші новини