У контролі на препаратах, іммуноокрашенних на PCNA, проліферуючі клітини сконцентровані в області капсули. За даними комп'ютерного аналізу, кількісна щільність PCNA-позитивних ядер в центральній зоні в 100 мкм нейтральнішою капсули становить 10642 ± 284 на 1 мм2 площі паренхіми. У цих же зонах кількісна щільність загиблих клітин по ядрах, пофарбованим методом Мозера, майже в 2 рази вище - 22983 ± 488. У ядрах інтерфазних клітин визначаються 1-2 ядерцевих організатора. Зміст клітин із зонами ядерцевих організаторів визначається в кількості 4450 на 1 мм2. При дії Вілона в культурі тканини селезінки 1-денних щурят периферична зона росту, обумовлена Морфометрично при фазово-контрастної мікроскопії, зменшувалася на 40% + 3 (ге = 31, рlt; 0,05) порівняно з ІП контрольних експлантатов (п = 25 ). Як ми зазначали в попередньому розділі лекції, це може бути пов'язано з процесами селекції лімфоцитів в селезінці в період неонатального розвитку, так як вже у 21-денних щурів Вілон починає стимулювати периферичну зону росту експлантатов. При вивченні препаратів, пофарбованих гематоксиліном і еозином, істотних змін в гістологічному будові периферичної зони експлантатов 3-денних щурів після додавання в середовище культивування Вілона не виявлено. Разом з тим у порівнянні з контрольною групою в більш віддалених від капсули в центральному напрямку ділянках експлантатов паренхіма органу виглядає збереглася набагато краще.
Результати порівняльного імуногістохімічного дослідження показують, що в дослідній групі експлантатов від 3-денних щурят в області капсули і в субкапсулярной зоні визначається більш висока концентрація проліферуючих клітин. За даними комп'ютерного аналізу, кількісна щільність PCNA-позитивних ядер в периферійній зоні збільшується до 11619 ± 368, а щільність загиблих клітин знижується до 17719 ± 1558. У той же час вміст клітин з ядерцевих організаторів визначається на рівні контрольної групи. Вілон в культурі тканини селезінки 21-денних щурят посилював розвиток периферичної зони росту на 35 + 1% (п = 30, рlt; 0,05) порівняно з ІП контрольних експлантатов («= 25). Кількісна щільність PCNA-позитивних ядер у контролі становить 6549 ± 508 на 1 мм2, а щільність загиблих клітин - 15919 ± 567. При фарбуванні на ядерцеві організатори по периферії експлантатов 3-тижневих щурів контрольної групи виявляється 2714 ± 120 функціонуючих інтерфазних клітин. На серійних зрізах у відповідних зонах локалізуються поодинокі Ig-позитивні клітини. При дії Вілона знайдено, що більша частина проліферуючих клітин сконцентрована в 100-мікронною периферійній зоні, проте на відміну від попередньої групи окремі ядра з інтенсивною реакцією на PCNA виявляються навіть в центральних зонах органотіпіческой культури серед полів загиблої тканини. Кількісна щільність проліферуючих клітин знижується до 4912 ± 246 на 1 мм2, а щільність загиблих клітин - до 11546 ± 478. У той же час кількісна щільність клітин з ядерцевих організаторів збільшується до 3536 ± 101, а на відповідних серійних зрізах виявляються скупчення імуноглобулін-позитивних клітин у вигляді невеликих груп.
У 24-місячних щурів Вілон пригнічував зону росту експлантатов селезінки на 25 + 3% (га = 23, рlt; 0,05) порівняно з ІП контрольних експлантатов (? Г = 22). Капсула контрольних та експериментальних експлантатов щодо товста, складається з щільної волокнистої сполучної тканини, що містить, крім клітин, численні колагенові і ретикулярні волокна. На значному протязі визначається повний некроз-тканинної основи і гомогенізація фібрилярних структур. При мікроскопічному дослідженні фрагментів селезінки старих тварин відзначається значне звуження подкапсульной зони регенерації. У контрольних експлантатов рідкісні клітини з PCNA-позитивними ядрами дифузно розподілені в 100-мікронною подкапсульной зоні. Їх кількісна щільність істотно менше, ніж у молодих тварин, і становить 1400 ± 170 клітин на 1 мм2. Клітини з позитивною реакцією на ядриш-ковие організатори розташовуються переважно в периферійній зоні поодинці або утворюють невеликі групи.
Гістологічний малюнок периферичної зони експлантатов 2-річних щурів після додавання в середовище культивування Вілона відповідає варіантам контрольної групи. Однак візуалізіруемого зона регенерації розширюється. Ретикулярні клітини виявляються в двох різних тканинних модифікаціях: одинично розсіяні клітини і відносно великі ретикулярні комплекси. Звертає увагу добре зберігання цитоплазми клітин в таких комплексах і ультраструктурні ознаки внутрішньоклітинної форми регенерації. При іммуноокрашіваніі на PCNA визначається розширення зони локалізації проліферуючих клітин, а за даними комп'ютерного аналізу, їх кількісна щільність збільшується на 25% щодо контрольної групи і становить 1745 ± 770 клітин на 1 мм2. Клітини з ідентифікованими ядерцевих організаторів виявляються не тільки по периферії, а й у більш глибоких зонах. Їх вміст перевищує рівень контрольної групи більш ніж на 50%.
Кількість загиблих клітин однаково велике в контрольних та експериментальних експлантатов. Результати проведених нами досліджень показують, що лімфоїдна тканина в органотіпіческой культурі селезінки в процесі її культивування гине в центральної і периферичної зонах експлантатов від щурів 1-денних і 24-місячних, але в експлантатов від 21-денних щурів проліферує в периферійній зоні росту. Коли ІП периферичної зони росту знижений по відношенню до контролю в експлантатов 1-денних і 24-місячних тварин, спостерігається збільшення показника кількісної щільності PCNA-позитивних ядер (NPCNA). У експлантатов 3-тижневих тварин, навпаки, при збільшенні ІП зони росту знижено показник кількісної щільності PCNA-позитивних ядер (NPCNA). Це цікаве явище, можливо, пов'язано в якійсь мірі з тим, що посилення пролиферативного потенціалу в центральній зоні знижує можливості проліферації клітин в периферійній зоні, і навпаки, - зниження проліферації в центральній зоні (21-денних щурів) веде до посилення проліферативних процесів в периферійній зоні.
Відомо, що більшість тканин і органів мають здатність до регенерації, різні лише її форми залежно від структурно-функціональної спеціалізації їх клітинних елементів. Як випливає з представлених вище матеріалів, для експлантатов селезінки молодих тварин найбільш характерна регенерація тканини шляхом гіперплазії клітин. За даними кількісного аналізу, об'єктивно реєструється ефектом впливу Вілона на експлантати 1-денних тварин є посилення проліферативної активності клітин в центральних зонах зонах регенерації (на 9%) і зниження кількісної щільності загиблих спленоцитів (на 22%). Разом з тим периферична зона росту експлантатов від 1-денних тварин помітно нижче, ніж у контролі (на 40%). Для органотіпіческой культури 21-денних щурів при дії Вілона в центральній зоні характерно достовірне зниження числа загиблих клітин (на 38%) і збільшення числа активно функціонуючих стромальних елементів (на 29%). Відмінною характеристикою дії Вілона на органотипових культуру селезінки 21-денних щурів є достовірне зниження проліферативної активності спленоцитів (на 10%). На цьому тлі різко збільшується (на 35%) периферична зона росту (на 35%).
Пояснення цього феномена може лежати в генетично запрограмованих для цього віку тварин процесах диференціювання клітин селезінки. Дійсно, поява в пульпарного тяжах при дії Вілона молодих дифференцирующихся ретикулярних і плазматичних клітин може свідчити про вихід частини оновлюються клітин з циклу проліферації, їх диференціювання і функціональному дозріванні. Прямим доказом цього може служити достовірне збільшення числа клітин з ядерцевих організаторів, а непрямим підтвердженням - поява скупчень іммуноглобулінпозітівних клітин на серійних зрізах цих експлантатов.
Найцікавіші новини