В експериментах було задіяно 200 самців щурів лінії Вістар масою 180-200 г, з цієї кількості (з числа тих, що вижили) після опромінення в летальному діапазоні доз (в дозах 7 і 7,5 Гр в двох різних повторностях досвіду) і інтактних щурів було відібрано по 10 особин у кожній експериментальній точці для проведення морфологічних досліджень ендокринних клітин дванадцятипалої кишки через 6 і 12 місяців після спільного одноразового опромінення. Всі тварини були розділені на 4 групи: групи 1,1А - інтактні щури- групи 2,2А - щури, піддані загальному однократному опроміненню в дозах 7 Гр і 7,5 Гр відповідно. Загальна одноразове гамма-опромінення тварин груп 2, 2а виконано на кобальтовому апараті «ГУБ 20000» при потужностях дози 1,60 і 1,77 Гр / хв відповідно.
Виділення проксимального відділу дванадцятипалої кишки проводили вранці з 10 до 12 годин при природному освітленні під нембуталовим наркозом (50 мг / кг): у тварин 1-ї та 2-ї груп - через 6 місяців після впливу іонізуючої радіацією, а у тварин груп 1а і 2а - через 12 місяців після опромінення. Пролонговану опромінення. В експеримент було залучено 60 самців щурів лінії Вістар масою 140-160 г. Тварини були розділені на 2 групи: 20 особин - інтактні щури і 40 - щури, піддані пролонгованому опроміненню протягом 20 днів в сумарній дозі 2,5 Гр. Такий вибір сумарної дози іонізуючого випромінювання обумовлений тим, що в раніше проведених експериментах доза однократного гострого опромінення в 1 Гр не викликала в ендокринних клітинах ШКТ тварин деструктивних порушень і масивного викиду гормонів, а починаючи з 5 Гр дані ультраструктурні зміни вже надійно реєструвалися. У літературі нами не було знайдено даних про проведення раніше досліджень ультраструктурной організації ендокринних клітин ШКТ після впливу пролонгованого опромінення, і обрана для наших дослідів доза опромінення грунтувалася на відомому положенні про те, що ефективність пролонгованого опромінення зазвичай менше, ніж рівного йому по дозі гострого опромінення. Можна було сподіватися, що доза 2,5 Гр близька до нижньої межі реєстрованого ефекту пролонгованого опромінення для APUDцітов, що й підтвердили надалі результати проведених експериментів.
Гамма-опромінення проводилося в лютому 2001 р за допомогою установки «Експеримент» (джерело 137Cs- потужність поглиненої дози в прямому пучку 5,32 мГр / год). Тварини отримували щоденну дозу 0,125 Гр протягом 20 днів. Для електронно-мікроскопічного дослідження було згодом відібрано по 9 щурів з облученной і интактной груп. Проксимальний відділ дванадцятипалої кишки у тварин виділяли при природному освітленні через 1 добу після закінчення експерименту. Підготовку тканинних зразків і їх ультраструктурномудослідження здійснювали в наступній послідовності. Електронно-мікроскопічне дослідження. Витягнутий шматочок тканини проксимального відділу дванадцятипалої кишки за допомогою леза нарізали на шматочки розміром 1 х 3 мм у краплі глютаральдегіду (2,5%). Для фіксації використовували суміш Карновского, що складається з 25% -ного розчину глютаральдегіду (10 мл), 40% -ного розчину формальдегіду (5 мл) і 0,1 М розчину фосфатного буфера рН 7,2-7,4 (85 мл). Матеріал фіксувався в суміші Карновского протягом 2 годин при кімнатній температурі з подальшою дофіксаціей в 1% -ному розчині чотириокису осмію протягом 1 години при кімнатній температурі.
Після промивання і зневоднення в спиртах висхідної фортеці зразки тканини просочувалися і заливалися в суміш Епонім, що складається з двох складових компонентів: суміші А - 62 мл Епона 812 і 100 мл DDSA (додецил-бурштиновий ангідрид) і суміші В - 100 мл Епона 812 і 89 мл MNA (метил-надік ангідрид). Повна суміш Епонім готувалася з 2,5 мл суміші А, 2,5 мл суміші В і 0,15 мл (4 краплі) затверджувача DMP-30 (2, 4, 6 трідіметіл-амінометил-фенол). Полімеризація залитого матеріалу проводилася протягом ночі в термостатах при 37 ° С і потім протягом 24 годин при 58 ° С. Для контролю взяття саме тієї ділянки тканини, в якому присутні необхідні для дослідження клітини, попередньо готували напівтонкої зрізи (завтовшки 1 мкм) і досліджували їх за допомогою світлового мікроскопа. Після цього блоки заточували таким чином, щоб ультратонкі зрізи містили тільки необхідні для дослідження клітини. Для отримання напівтонку зрізів використовували ультрамікротом LKB-7A (LKB, Швеція) і виробник ножів KNIF - MARKER LKB-91 (LKB, Швеція).
Напівтонкої зрізи наносилися на предметні скла в краплю дистильованої води і нагрівалися до повного висихання краплі і розправлення зрізу. Потім зрізи послідовно офарблювалися метиленовим синім і азуром-11, що дозволяло орієнтувати матеріал для прицільної заточки. За допомогою світлового мікроскопа в слизовому шарі епітелію дванадцятипалої кишки для прицільної заточки вибиралася переважно область крипт і підстави ворсинок, де знаходиться найбільша кількість ендокринних клітин дванадцятипалої кишки. Ультратонкі зрізи (завтовшки 150-50 нм) готувалися за допомогою того ж обладнання, що і напівтонкої зрізи, тільки до ножа прикріплялися спеціальні ванночки, наповнені дистильованою водою, на поверхню якої зрізи переходили при різанні. Отримані таким чином ультратонкі зрізи монтувалися на «бленди» - мідні сітки діаметром до 3 мм, які мали на своїй поверхні отвори діаметром 0,01 мм, що дозволяло досліджувати в електронному мікроскопі 8-10 полів зору. Для уникнення деформації зрізів при дії електронного променя попередньо на чисті сітки наносилася опорна плівка з розчину формвара, на яку знімалися зрізи з поверхні води.
Зрізи контрастували уранілацетатом і цитратом свинцю за Рейнольдсу. При спільному використанні уранілацетатом і цитрату свинцю контрастність препарату збільшується в значно більшій мірі, ніж при роздільному застосуванні цих речовин. Для електронно-мікроскопічного дослідження зрізи на Бленд контрастували спочатку 4,5% -ним розчином уранілацетатом протягом 10 хвилин з ретельною наступним промиванням сіток дистильованою водою, потім ще протягом 10 хвилин цитратом свинцю за модифікованим методом Рейнольдса в присутності їдкого натру для поглинання С02, також з наступним промиванням. Електронно-мікроскопічні дослідження проводилися на електронному мікроскопі JEM - 100S (JEOL, Японія) в трансмісивному режимі. Фотозйомка тканинних і клітинних ділянок проводилася вбудованої в мікроскоп фотокамерою при автоматичному експонуванні з маркуванням на фотоплівці збільшення і номера кадру. Для електронно-мікроскопічних досліджень ультраструктури ендокринних клітин було вибрано однакове збільшення мікроскопа 10500 для всіх знімків для полегшення ідентифікації різних типів ендокринних клітин, локалізованих в слизовому шарі дванадцятипалої кишки, по розташованим в їх цитоплазмі секреторних гранул різної форми, щільності і розмірів.
Найцікавіші новини