Під впливом НСl розривається тетрапірроловая зв'язок білірубіну і утворюються два діпіррола, які діазотіруются діазобензосульфоновой кислотою з утворенням рожево-фіолетового азобілірубіна. Зв'язаний білірубін реагує швидко, незв'язаний білірубін реагує після додавання кофеїнового реактиву.
Необхідні реактиви
1. Кофеїн.
2. Натрію бензоат.
3. Натрію ацетат 3-водний.
4. Кофеїновий реактив: 5 г кофеїну, 7,5 г бензоату натрію, 12,5 г ацетату натрію розчиняють в 90 мл води, нагрівають до температури 50-60 ° С, добре перемішують. Після охолодження доливають водою до 100 мл. Розчин стабільний протягом 2 тижнів.
5. Натрію хлорид, 154 ммоль / л (ізотонічний розчин): 0,9 г хлориду натрію поміщають в мірну колбу місткістю 100 мл і доливають до мітки водою.
6. НСl концентрована.
7. Сульфаниловая кислота.
8. Діазосмесь. Діазореактів I: 5 г сульфаниловой кислоти розчиняють при нагріванні в 300-400 мл води, додають 15 мл концентрованої НСl. Якщо сульфанілова кислота повністю не розчиняється, колбу поміщають в теплу воду і помішують. Тільки після розчинення і охолодження розчин доливають водою до 1 л. Реактив стабільний при зберіганні в посуді з темного скла. Діазореактів II: натрію нітрит, 5 г / л (0,07 моль / л): 0,5 г нітриту натрію поміщають в мірну колбу місткістю 100 мл і доливають водою до мітки. Реактив стабільний протягом 2-3 тижнів. при зберіганні в посуді з темного скла. Перед роботою змішують 10 мл діазореактивом I і 0,3 мл діазореактивом II.
9. Білірубін для побудови калібрувального графіка, 800 мг / л, або 1368 мкмоль / л. Комерційні препарати кристалічного білірубіну містять різні домішки, які можуть заважати реакції азосочетания. Рекомендується використовувати набір Біо-Ла-Тест "Білірубін-еталон", що містить білірубін високого ступеня чистоти з коефіцієнтом молярної екстинкції не менше 6,05 ґ 104 л при 453 нм і розчиненні в хлороформі. Розчини білірубіну нестійкі, тому їх готують з додаванням білка в якості стабілізатора. Комерційні препарати білірубіну не пов'язані з глюкуроновою кислотою.
10. Натрію карбонат, 0,1 моль / л: 10,6 г безводного NаСО3 розчиняють і доливають до 1 л водою.
11. Оцтова кислота, 4 моль / л: 25 мл крижаної оцтової кислоти доливають до 100 мл водою.
Хід визначення
У 3 пробірки (2 досвідчені проби і неодружена) вводять реактиви, як зазначено в таблиці.
Для визначення пов'язаного білірубіну вимір проводять через 5-10 хв після додавання діазосмесі, так як при тривалому стоянні в реакцію вступає непов'язаний білірубін. Для визначення загального білірубіну пробу для розвитку забарвлення залишають стояти 20 хв, після чого вимірюють на фотометрі. При подальшому стоянні забарвлення не змінюється.
Вимірювання проводять при довжині хвилі 500-560 нм (зелений світлофільтр) в кюветі з товщиною шару в 0,5 см проти води. З показників, отриманих при вимірюванні загального та зв'язаного білірубіну, віднімають показник холостий проби.
Розрахунок роблять за каліброване графіком. Знаходять вміст загального та зв'язаного білірубіну.
Побудова калібрувального графіка
Спосіб I - Шелонг-Вендес використанням стабілізуючого властивості білка сироватки крові. Основний розчин білірубіну: в колбі місткістю 50 мл розчиняють 40 мг білірубіну в 30-35 мл 0,1 моль / л розчину карбонату натрію Na2CO3. Добре збовтують, не допускаючи утворення бульбашок. Доводять до 50 мл 0,1 моль / л розчином Nа2СО3 і кілька разів перемішують. Розчин стійок тільки протягом 10 хв від початку приготування. Надалі відбувається окислення білірубіну.
Робочий розчин білірубіну: до 13,9 мл свіжої негемолізірованной сироватки здорової людини додають 2 мл свіжоприготованого основного розчину білірубіну і 0,1 мл 4 моль / л розчину оцтової кислоти. Добре перемішують. При цьому виділяються бульбашки вуглекислого газу. Робочий розчин стійок протягом декількох днів. Цей розчин містить точно на 100 мг / л, або 171 мкмоль / л, білірубіну більше, ніж сироватка, взята для приготування розчину. Щоб виключити при розрахунках кількість білірубіну, що міститься в цій сироватці, при вимірюванні на фотометрі з величин екстинкції калібрувальних проб віднімають величини екстинкції відповідних розведень компенсаційної рідини.
Для приготування компенсаційної рідини змішують 13,9 мл тієї ж сироватки, яка використовувалася для приготування калібрувального розчину білірубіну, 2 мл 0,1 моль / л розчину карбонату натрію і 0,1 мл 4 моль / л розчину оцтової кислоти. Для побудови калібрувального графіка готують ряд розведень з різним вмістом білірубіну.
До отриманих разведениям додають по 1,75 мл кофеїнового реактиву і по 0,25 мл діазосмесі. При появі помутніння можна додати по 3 краплі 30% -ного розчину їдкого натру. Вимірювання проводять при тих же умовах, що і в дослідних пробах, через 20 хв.
З компенсаційної рідини готують розведення, аналогічні калібрувальним (як зазначено нижче), і далі обробляють їх так само, як калібрувальні проби.
Спосіб II - калібрувальний графік будується по готовому набору реактивів "Білірубін-еталон" ("Лахема").
Набір Біо-Ла-Тест "Білірубін-еталон" включає:
1) білірубін ліофілізований (точна концентрація білірубіну наведена на етикетці флакона);
2) альбумін ліофілізований.
Спосіб приготування розчинів білірубіну вказано в інструкції до набору.
Калібрувальна крива линейна до 170 мкмоль / л.
Примітка
На правильність методу впливає спосіб побудови калібрувальної кривої. Ряд речовин - гідрокортизон, андрогени, еритроміцин, глюкокортикоїди, фенобарбітал, аскорбінова кислота - викликають інтерференцію.
Клініко-діагностичне значення
При печінкових желтухах (гепатити, цирози) в крові відзначається різке збільшення вмісту білірубінглюкуроніду, що відбувається головним чином від руйнування печінкових клітин. Пошкодження мембран гепатоцитів призводить до виходу в кров і прямого, і непрямого білірубіну.
Деяке зростання кількості вільного білірубіну настає внаслідок порушення функції печінки (зменшення активності трансглюкуронідази та інших ферментних систем, що беруть участь в глюкуронідірованіі).
Значне збільшення вмісту білірубіну сироватки при механічних (застійних) желтухах обумовлено переповненням жовчних шляхів внаслідок закупорки, розриву їх і переходу жовчі в русло крові. Обтураційна жовтяниця супроводжуються різким збільшенням прямого білірубіну в крові. Тривалий застій жовчі в печінці може викликати запальні зміни в гепатоцитах з подальшим збільшенням вмісту непрямого білірубіну сироватки крові.
Різке зростання кількості вільного білірубіну при гемолітичній жовтяниці відбувається в результаті гемолізу, що приводить до посиленого утворення непрямого білірубіну.
Найцікавіші новини