Сечовина утворює з діацетілмонооксімом в сильнокислой середовищі в присутності тіосемікарбазіда та іонів тривалентного заліза червоний комплекс.
Необхідні реактиви
1. Трихлоруксусная кислота, 100 г / л.
2. Діацетілмонооксім, 25 г / л водний розчин. Реактив стабільний.
3. Тіосемікарбазід, 2,5 г / л водний розчин. Для приготування реактиву можна користуватися також тіосемікарбазіда гідрохлорідом- останній застосовується у вигляді 3,2 г / л водного розчину. Обидва реактиву стабільні при зберіганні в темному посуді при кімнатній температурі.
4. Сірчана кислота концентрована.
5. Ортофосфорная кислота 85% -ва.
6. Хлорне залізо. Основний розчин хлорного заліза: 5 г хлорного заліза доводять до 100 мл водою і підкислюють додаванням 1 мл концентрованої сірчаної кислоти. З основного розчину готують робочий розчин хлорного заліза: 1 мл основного розчину хлорного заліза доводять до 100 мл водою, потім додають 8 мл концентрованої сірчаної кислоти і 1 мл 85% -ної ортофосфорної кислоти. Зберігають у темному посуді. Придатний протягом 2 тижнів.
7. Бензойна кислота, 2 г / л. 0,2 г кристалічної бензойної кислоти розчиняють у 100 мл води при інтенсивному перемішуванні на водяній бані.
8. Сечовина для приготування калібрувального розчину. Готують 7 ммоль / л розчин сечовини: 42 мг сечовини розчиняють у воді в мірній колбі місткістю 100 мл. Як розчинник можна використовувати 2 г / л розчин бензойної кислоти. Калібрувальний розчин, приготовлений на розчині бензойної кислоти, стабільніше, ніж водний- 1 мл калібрувального розчину містить 0,007 ммоль сечовини.
9. Кольоровий реактив: до 30 мл робочого розчину хлорного заліза додають 20 мл води, 1 мл 25 г / л розчину діацетілмонооксіма і 0,25 мл 2,5 г / л розчину тіосемікарбазіда. Кольоровий реактив готують щоразу перед вживанням.
Хід визначення сечовини в сироватці крові
Досвідчена проба: у центрифужную пробірку наливають 0,8 мл води, 0,2 мл сироватки і 1 мл 100 г / л розчину трихлороцтової кислоти, змішують. Через 15-20 хв центрифугують. У чисту пробірку вносять 0,5 мл надосадової рідини і 5 мл кольорового реактиву. Пробірку витримують на киплячій водяній бані протягом 20 хв, потім охолоджують протягом 2-3 хв під проточною водою. Вимірювання проводять на фотометрі при довжині хвилі 530-560 нм (зелений світлофільтр) проти холостий проби в кюветі з товщиною шару в 1 см. Неодружену пробу ставлять так само, як досвідчену, але замість надосадової рідини беруть 0,5 мл води.
Розрахунок проводять за формулою шляхом порівняння з калібрувальної пробій. Калібрувальну пробу ставлять аналогічно досвідченою, але замість сироватки беруть 0,2 мл калібрувального розчину.
Концентрація сечовини, ммоль / л:
Еоп / Ек ґ Ск,
де Еоп - екстинкція дослідної проби;
Ек - екстинкція калібрувальної проби;
Ск - концентрація сечовини в калібрувальному розчині, 7 ммоль / л.
Визначення сечовини в сечі проводять аналогічно визначенню сечовини в сироватці крові, але замість сироватки беруть 0,2 мл розведеної сечі. Паралельно обробляють калибровочную пробу, як описано для визначення сечовини в сироватці крові.
Розрахунок сечовини на добове кількість сечі проводять за такою формулою:
Мсут = Ск ґ Еоп ґ а ґ К / Ек ґ б,
де Мсут - кількість сечовини в добовій сечі, ммоль;
Еоп - екстинкція дослідної проби;
Ек - екстинкція калібрувальної проби;
Ск - вміст сечовини в калібрувальному розчині, ммоль;
а - добова кількість сечі, мл;
б - кількість сечі, взяте на аналіз, мл;
К - коефіцієнт розведення сечі.
Примітки
1. Вимірювання проводять не пізніше ніж через 15 хв після охолодження проб зважаючи нестійкості забарвлення.
2. Через нестійкості пофарбованого комплексу сечовини з діацетілмонооксімом і залежності забарвлення від умов нагрівання калибровочную пробу визначають паралельно кожної серії досвіду.
3. При вмісті сечовини в сироватці крові вище 17 ммоль / л сироватку розводять фізіологічним розчином хлориду натрію, а результати множать на коефіцієнт розведення.
4. Для перерахунку на азот сечовини результати слід розділити на 2,14.
Найцікавіші новини