» » Методологія вивчення структурно-функціональної організації нейроендокринних клітин шлунка і кишечника


Методологія вивчення структурно-функціональної організації нейроендокринних клітин шлунка і кишечника

Методологія вивчення структурно-функціональної організації нейроендокринних клітин шлунка і кишечника
Виробляючи різні фізіологічно активні речовини, клітини дифузної ендокринної системи володіють певними загальними біохімічними, цитохімічними і ультраструктурнимі ознаками, які відрізняють їх від інших видів клітин. Зазначені властивості клітин APUD-системи послужили основою для розробки і застосування комплексу чутливих методів дослідження: гістохімічних та імуногістохімічних, радиоавтографии, гібридизації in sito специфічних мРНК та електронної мікроскопії, - здатних об'єктивно верифікувати синтезовані продукти і вивчити їх метаболізм і цитохімічних патологію.

Гістохімічні методи. До традиційних гістохімічним методам виявлення клітин ДЕС відносяться імпрегнація сріблом, забарвлення свинцевим гематоксиліном і флуоресцентний аналіз. З великого числа методів імпрегнації сріблом найбільш часто застосовують аргірофільних реакції по Грімеліусу, Севьер - Мунгер, Давенпорт і аргентаффінную реакцію по Массон. При цьому ряд клітин виявляє аргірофільних властивості, т. Е. Вони виявляються тільки після впливу якого-небудь відновника. Деякі клітини є аргентаффіннимі: вони не потребують стороннього відновник, оскільки містять високоактивні речовини, що володіють здатністю самостійно відновлювати солі срібла. Методи імпрегнації сріблом досить прості у виконанні, дають добре відтворювані результати і дозволяють проводити морфометрические дослідження для вивчення поведінки ендокринних клітин при патологічних станах.

Експериментально встановлено, що позитивну реакцію по Грімеліусу дає більшість відомих ендокринних клітин ШКТ, А- і РР-клітини острівців підшлункової залози, С-клітини щитовидної залози. Аргірофільних клітини також виявляються в гіпофізі, в паращитовидних залозах, в мозковій речовині надниркових залоз і парагангліях. За методом Севьер - Мунгер інтенсивно імпрегніруются ЄС-, ECL- і К-клітини в ШКТ і С-клітини щитовидної залози. Модифікований метод Давенпорта дозволяє селективно виявляти D-клітини, що виробляють соматостатин. Аргентаффінний метод Массона в модифікації Гамперля застосовують для ідентифікації ЄС-клітин.

При імпрегнації зрізів вищевказаними методиками гранули ендокринних клітин забарвлюються в чорний або темно-коричневий колір. Крім того, використовується метод Севки, при якому ЄС-клітини забарвлюються в оранжевий колір, ECL-клітини - в червоний, А-клітини - в жовто-зелений, НА-клітини - в синьо-зелений або фіолетовий колір. Свинцевим гематоксилином вибірково забарвлюються А-клітини острівців підшлункової залози, ЄС-, G-, Х-клітини ШКТ, клітини гіпофіза, мозкової речовини наднирників і каротидного тіла. Як правило, ендокринні клітини, ідентифіковані свинцевим гематоксилином, виявляють аргірофільних властивості при фарбуванні за методом Грімеліуса. Для виявлення внутрішньоклітинної локалізації біогенних амінів і Топохимічеськие диференціювання катехол- і індоламін розроблено високочутливі методи з обробкою тканини парами формальдегіду, гліоксилової кислоти і ортофталевої альдегіду. Ці методи засновані на здатності моноаминов конденсуватися із зазначеними сполуками і утворювати флуорофор. Різниця спектрів флуоресценції продуктів конденсації дозволяє диференціювати аміни. Цим методом виявляються ЄС-клітини, моноамін-містять клітини гіпофіза і клітини мозкової речовини надниркових залоз. Деякі сполуки, що не виявляються за допомогою формальдегіду, N-ацетильовані індоламін (мелатонін) і метоксильованих катехоламіни В-метоксітірамін) можна ідентифікувати методом конденсації з гліоксилової кислотою. Ортофталевої альдегід застосовують для виявлення гістаміну.



Метод флуоресценції, індукованої формальдегідом після введення діоксіфеніламіна (ДОФА), використовують для вивчення здатності ендокринних і деяких неендокрінних клітин поглинати і декарбоксілізіровагь екзогенно введені попередники біогенних амінів. Імуногістохімія. У порівнянні з класичними гістологічними і гістохімічними забарвленнями методи імуногістохімії дозволяють з високою вибірковістю виявляти і локалізувати в тканинах, клітинах і внутрішньоклітинних структурах молекулярні компоненти, що володіють антигенними властивостями. Отримання моноклональних антитіл і іоліклональних антисироваток до продуктів життєдіяльності ендокринних клітин, а також можливість маркувати антитіла флуоресцентними барвниками (флуоресцеінізотіоціонатом, тетраметілродамінізотіоціонатом), ферментами (перок-сідазой, лужної фосфотазу і глюкозооксідазой) або металами (колоїдним золотом) без зміни їх иммунореактивности відкрили широкі перспективи для вивчення структурно-функціональної організації клітин ДЕС. При використанні антитіло-ферментних кон'югаторов пов'язаний з антитілом фермент виявляють на заключному етапі проведення реакції «антиген - антитіло». Утворені в результаті спеціальних гистохимических реакцій полімерні барвники дають інтенсивно забарвлений продукт, який можна спостерігати в звичайному світловому мікроскопі. Крім того, продукт ферментативних реакцій можна зробити електронно-щільним і використовувати для виявлення антигенів на ультраструктурному рівні.

Для точної ідентифікації ендокринних клітин і встановлення типу продукуються ними гормонів використовують різні способи иммуногистохимического аналізу із застосуванням антитіл до активних пептидів, біогенних амінів і специфічним для даної популяції клітин білкам і ферментам, таким як хромогранина і нейроспецифічні енолаза. Методи імуногістохімії відрізняються високою специфічністю. Однак ряд труднощів (можливість перехресних реакцій, неспеціфіцеская сорбция антитіл, необхідність збереження в тканини досліджуваного антитіла без зміни його иммунореактивности та ін.) Вимагає критичного розгляду результатів для їх об'єктивної трактування. Радіоавтографія. Методи фотодетекторной реєстрації сполук, мічених радіоактивними ізотопами, застосовують для вивчення метаболічних процесів в ендокринних клітинах, трансмісії гормонів як посередників хімічної інформації на клітини-мішені і біохімічних механізмів, включених в їх реалізацію.



Поєднання методів зв'язування високоспецифічних радіолігандов (мічених гормонів або їх аналогів) з Радіоавтографія дозволяє візуалізувати анатомічну і клітинну локалізацію рецепторів до біогенних амінів та регуляторним пептидів. Радіоавтографіческій і иммуногистохимический аналіз дає можливість вивчати транспорт, депонування, органні особливості утилізації та метаболізму екзогенно введених гормонів. Використання мічених тритієм попередників біогенних амінів (5-оксітріптофана і ДОФА) представляє певну цінність для вивчення APUD-механізму, ідентифікації типів APUDoціtob та оцінки їх функціональної активності в умовах патології. Для вирішення питання про специфічність синтезу, а не накопичення активних речовин певними типами клітин, використовують метод гібридизації «in situ», що дозволяє ідентифікувати мРНК, що кодують унікальні послідовності амінокислот при синтезі білків, оцінити рівень експресії генів цих білків і досліджувати механізми її регуляції. В основі методу лежить реєстрація мічених фрагментів ДНК і РНК, комплементарних до досліджуваної мРНК.

Електронна мікроскопія. У топографічному плані клітки ДЕС локалізуються або дифузно (травний тракт, сечостатеві шляхи), або групами серед клітин будь-якого органу (мозкова речовина наднирників, острівці Лангерганса в підшлунковій залозі). Такі морфологічні ознаки, як розміри і форма (округла, трикутна, наявність острівців), ультраструктура ядра, ядерець, ендоплазматичної сітки, пластинчастого комплексу Гольджі, не є достатньо специфічними для всієї популяції ендокринних клітин в цілому. Зазначені ознаки залежать від локалізації цих клітин та їх функціонального стану. Як уже зазначалося, основною відмінною ознакою клітин ДЕС є наявність в цитоплазмі секреторних гранул, які є остаточним місцем освіти і зберігання пептидних гормонів, а також накопичення біогенних амінів, синтез яких здійснюється в цитозолі клітини. Електронна мікроскопія дозволяє розрізняти різні типи ендокринних клітин за що містяться в їх цитоплазмі характерним гранулам і вивчати ультраструктурні зміни на різних стадіях розвитку патологічного процесу.

Зрілі секреторні гранули представляють собою багатокомпонентні структури. Крім активних пептидів і моноаминов, в гранулах містяться попередники пептидів і великі білкові молекули, АТФ та інші аденін-нуклеотиди. Саме цей складний склад визначає розміри, форму і внутрішню будову секреторних гранул, ідентифікованих на ультраструктурному рівні, а також можливість застосування різних гисто- і імуногістохімічних методів дослідження. Специфічність будови гранул і їх здатність до осмофіли, аргентаффінность і аргірофілія служать ультраструктурнимі діагностичними ознаками багатьох типів ендокринних клітин. Розроблена номенклатура клітин заснована на ультраструктурному типі гранул і імуногістохімічної ідентифікації синтезованого гормону. Відрізнити ендокринні гранули від ендокринно-подібних (іншої хімічної природи) дозволяє Ультраструктурних цитохимический метод уранаффінной реакції. При його використанні вибірково контрастируются гранули ендокринних клітин, ядерний хроматин, ядерця і рибосоми, а лізосоми, ліпофусціновие, лактальбуміновие і зімогенние гранули не фарбується.

Вдосконалені способи підготовки тканин, застосування очищених і моноклональних антитіл, введення в практику імуноцитохімії в якості електронно-щільної мітки колоїдного золота дозволяють в даний час не тільки вивчати на ультраструктурному рівні одночасну локалізацію декількох гормонів в одній клітці, але й диференціювати їх усередині клітини по гранулам. Методи електронно-мікроскопічної імуноцитохімії залишаються досить трудомісткими і складними для повсякденної роботи. Тому особливий внесок у класифікацію клітин ДЕС по секреторному продукту і виду ендокринних гранул вніс простий і надійний спосіб вивчення серійних напівтонких-ультратонких зрізів, при якому тип гормону ідентифікують імуногістохімічним методом на напівтонкої зрізі, а ендокринну клітку вивчають після прицільної заточки блоку на відповідному ультратонкому зрізі. На напівтонку зрізах зручно проводити радіоавтографіческіе дослідження, а після видалення заливальної середовища на них вдається провести багато гисто- і імуногістохімічні реакції.

Комплексний аналіз вивчення функціональної морфології ендокринних клітин заснований на поетапному застосуванні гисто- і імуногістохімічних методів, радиоавтографии, загальних і спеціальних методів, використовуваних в електронній мікроскопії. Ключова роль у встановленні типу продуцируемого гормону та ідентифікації клітин ДЕС належить імуногістохімії. Разом з тим деякі гістохімічні методи можна успішно застосовувати для вивчення ДЕС в цілому і виявлення окремих типів ендокринних клітин. Але проводити дослідження на ультраструктурному рівні з усіх розглянутих методів дослідження дозволяє тільки електронна мікроскопія. Більшість відомих ендокринних клітин ідентифіковано саме в результаті комплексних досліджень, що поєднують гистохимические, імуногістохімічні та ультраструктурні методи аналізу. Послідовне застосування сучасних методів дає можливість вивчати функціональний стан популяції ендокринних клітин ДЕС як в нормі, так і при патології, аналізувати ендокринну функцію тієї чи іншої клітини, визначати її тип і гормональний профіль, а також дослідити структурно-функціональні зв'язки ендокринних клітин.


Найцікавіші новини


Увага, тільки СЬОГОДНІ!

Увага, тільки СЬОГОДНІ!